スパロボ 30 ハイ ニュー

『スパロボDD』もう1機のνガンダム“Hi


Contents• RX78ガンダム 頭頂高:18. 0m、本体重量:43. 5段階ボーナス 運動性+20。 ビームライフル+ビームサーベルにカウンター属性。 なんとも地味な5段階ボーナス。 しかし運動性アップのおかげで一層攻撃を避けてくれるようになるし、これからの後継機にも改造値は引き継がれるから、ためらわずに機体の5段階改造はしておこう。 メイン武装 バルカン、ビームライフル、ビームサーベル、連続攻撃 漢らしいシンプルな武装のラインナップ。 最強攻撃の「連続攻撃」は5段階改造で攻撃力「4900」。 このガンダムでアムロの撃墜数を稼ぐには「連続攻撃」がカギ。 弾数は5発なので、スキル「Bセーブ」で攻撃回数をふやしておこう。 アムロの初期スキルとおすすめスキル• ニュータイプL5• 再攻撃• ヒットアンドアウェイ 登場初期から序盤ではすごく貴重なスキル「再攻撃」を持っているのが、頼もしすぎる。 アムロの技量の高さも相まってほとんどの敵を相手に再攻撃してくれる。 おすすめスキル• Bセーブ+2• サイズ差補正無視L3• 闘争心• ダッシュ• 先制攻撃 まず闘争心とサイズ差補正無視は必須スキル。 アムロが乗り継ぐ機体はどれも「弾数型」の武装がメインなので、「Bセーブ+2」は必須スキル。 ガンダム系は移動力が低いため、1ターン目でどこまで敵陣営に近づけるかが大事なので、 「先制攻撃」や「ダッシュ」も習得しておきたい。 エースボーナス 60機撃墜のエースボーナスは「技量+20、ニュータイプ専用武器の射程+1。 」になる。 この「技量+20」のおかげで再攻撃の発動率がグッと高くなる。 射程アップの恩恵は「ファンネル」が使えるようになってから。 精神コマンド アムロの習得する精神コマンドは、「集中、てかげん、直感、突撃、魂、覚醒」。 歴代スパロボのアムロらしい精神コマンドのラインナップ。 そうだね。 敵との距離が離れていても「突撃」を使って、遠距離から攻撃を仕掛けられることもありがたい。 アムロで敵30機を撃墜する 性能 基本性能は実はそんなにガンダムと変わらない。 攻撃力もフィンファンネルと連続攻撃、実はそこまで大きな攻撃力に開きはない。 むしろ近づいて攻撃できる連続攻撃の方が使い勝手は悪くない印象。 ここはお好みで使い分けてもいいと思う。

【スパロボ30】ボルテスVのおすすめ改造方針&おすすめスキル|スパロボ30攻略wiki


親にゲームを隠されては見つけ出しを繰り返す日々を送る。 新旧問わず、プレイ中のゲームをレポート、素朴な疑問を抱いてはメンバーに意見を求めたり、ネットの意見をまとめたりすることに余念がない。 1,049ビュー• 678ビュー• 474ビュー• 363ビュー• 322ビュー• 320ビュー• 141ビュー• 114ビュー• 112ビュー• 101ビュー• 96ビュー• 95ビュー• 88ビュー• 85ビュー• 83ビュー 【通りすがりのゲーマーさんたちのコメント】• 通りすがりのゲーマーさん より• 通りすがりのゲーマーさん より• 通りすがりのゲーマーさん より• 通りすがりのゲーマーさん より• 管理人 より• 夏海 より• 通りすがりのゲーマーさん より• 通りすがりのゲーマーさん より• 通りすがりのゲーマーさん より• 通りすがりのゲーマーさん より 【カテゴリー】•。 月間PV数70万以上。 一児(娘)の父。

スパロボ30 切り売りが酷い思うの俺だけ…?まとめ


【スパロボ30】νガンダムのおすすめ運用方法(アムロのスキル・精神コマンド)|スパロボ30攻略wiki" title="30 ニュー スパロボ ハイ">
移動力は低いので主力から引き離されないように、加速効果のある「先制攻撃」や、強化パーツなどで移動力のカバーとENを補助をしておきたい。 精神コマンド 健一 必中、狙撃、集中、熱血、絆、勇気 一平 てかげん、突撃、直感、友情、熱血、決意 大次郎 根性、気合、不屈、必中、鉄壁、気迫 日吉 閃き、分析、努力、幸運、脱力、補給 めぐみ 加速、先見、信頼、感応、かく乱、期待 ボルテスV 有料DLCである「ボルテスV」。 「反骨心」はたしか自分より技量の高い相手に「与ダメ1. 1倍」の効果があるんだよな。 この攻撃力の高さも「ファイナルガオガイガー」より高いからすさまじいものがある。 対して「ボルテスV」の場合は「グランドファイヤー」 こちらは射程4で移動後使えないので、コンバトラーVに比べると使いにくい武装。

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気力130以上で移動後に使えるオールレンジアタックが使えれば、1ターン目から大体の敵に攻撃を届かせることができる。 そのおかげですさまじい射程を誇り、通常のフィンファンネルで射程は脅威の11。 武装のほとんどは「弾数型」なので、「Bセーブ+2」は絶対に必須。 そのおかげも相まってアムロは特にHPの多い雑魚を相手にすさまじい撃墜力を誇る。 この「再攻撃」、ありがたいことに移動後に使える武器が「バルカン」や「ビームサーベル」などでも、再攻撃では「フィンファンネル」にもできる。


そして基本的にスパロボでは、弾数型の武装より、EN型の武装持ちのユニットが多い。 オールレンジアタックも「バリア貫通」性能が加わり、移動後に使えて射程も充分すぎるレベル。 HP2万程度ならアムロの再攻撃も組み合わせればほぼ余裕で撃墜できそう。 しかしフィンファンネルが移動後に使える仕様になっている。
タイトル: 公開特許公報(A)_グルタチオンの製造方法
出願番号: 2010253897
年次: 2012
IPC分類: C12P 21/00,C12N 15/09,C12N 1/19

原 清敬 仲山 英樹 近藤 昭彦 福田 秀樹 岩崎 晃 JP 2012100622 公開特許公報(A) 20120531 2010253897 20101112 グルタチオンの製造方法 株式会社カネカ 000000941 国立大学法人神戸大学 504150450 特許業務法人 安富国際特許事務所 110000914 原 清敬 仲山 英樹 近藤 昭彦 福田 秀樹 岩崎 晃 C12P 21/00 20060101AFI20120427BHJP C12N 15/09 20060101ALI20120427BHJP C12N 1/19 20060101ALI20120427BHJP JPC12P21/00 GC12N15/00 AC12N1/19 9 OL 13 4B024 4B064 4B065 4B024AA03 4B024AA05 4B024BA80 4B024CA01 4B024CA02 4B024CA09 4B024CA11 4B024CA20 4B024DA12 4B024EA04 4B024GA11 4B024HA01 4B024HA11 4B064AE01 4B064CA06 4B064CA19 4B064CC24 4B064DA01 4B064DA10 4B064DA16 4B065AA72X 4B065AA72Y 4B065AB01 4B065AC14 4B065BA02 4B065BD25 4B065CA16 4B065CA41 4B065CA44 4B065CA50本発明は酵母によるグルタチオンを製造する方法に関し、更に詳しくはグルタチオンを菌体外に生産する方法に関する。グルタチオンは、食品又は医薬品又は化粧品として有用である。グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、グリシンの3つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物などの多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸の代謝など、生体にとって重要な化合物である。そのため医薬品、食品、化粧品産業で注目されている。また、近年、グルタチオンに植物の生長を促進する効果があることなどの知見も得られるなど、農業を含めたさまざまな分野での用途が期待されている。グルタチオンの製造方法には発酵法、有機合成法、および酵素法があるが、工業的には、酵母を用いた発酵法により生産されている。グルタチオンは酵母の細胞内に蓄積されるため、実際には、酵母を培養し、その菌体中からグルタチオンを抽出する方法が広く用いられている。発酵法により生産した場合、有機合成法や酵素法のように菌体外で生産する場合に比べ、菌体内で生産されるが故に生産物であるグルタチオンが安定であるというメリットがあるが、その菌体内含量が低いというデメリットがあった。これまで、培養菌体中のグルタチオン含量を向上させ、生産性を向上させるために、グルタチオン生産に使用する酵母への突然変異処理(特許文献1、2、3)やグルタチオンの合成に関与する酵素を遺伝子組換えにより導入すること(特許文献4、5、6、7、8)、また、培地中にグルタチオンを構成する3種のアミノ酸であるL−グルタミン酸、L−システイン、グリシンを添加すること(特許文献9、10、11、12)が試みられてきた。しかし、菌体内のグルタチオン含量に限りがあり、また培地中の菌体濃度にも限界があるため、発酵法では培養液量あたりのグルタチオン生産量は十分ではなかった。一方、生産量を向上させるために、微生物菌体を界面活性剤、有機溶剤、細胞壁溶解酵素などで処理して細胞膜の透過性を高め、その処理菌体をグルタチオンの構成成分であるグルタミン酸、システイン、グリシンと接触させることにより、菌体外でグルタチオンを生産する酵素法が報告されている(特許文献12、13、14、15)。しかしながら、これらの方法において界面活性剤のみの処理ではグルタチオンの生産量は満足のいくものではなく(特許文献14)、また高価なアデノシンー5’−3リン酸(ATP)(特許文献15)や細胞壁溶解酵素(特許文献14)を界面活性剤とともに使用する方法は、生産コストがアップし、いずれの方法も工業的には実施しうるものではなかった。また、酵母にはグルタチオン分解活性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)が存在することが知られていたが、グルタチオンを生産する方法において、γ−GTP活性を低下あるいは欠損することの有用性は知られていなかった。このような背景のもと、菌体外にグルタチオンを生産する方法において、簡便で安価にその生産性を向上させる方法の開発が待望されていた。特開昭59−151894号公報特開2004−180509号公報特開平10−191963号公報特開昭61−52299号公報特開昭62−275685号公報特開昭63−129985号公報特開昭64−51098号公報特開平4−179484号公報特公昭54−997号公報特開昭48−92579号公報特開昭51−139686号公報特開昭53−94089号公報特開昭51−144789号公報特開昭53−94090号公報特開昭60−27396号公報本発明は、グルタチオンの経済的な工業生産方法を提供することを課題とする。上述の課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討した結果、酵母にはグルタチオン分解活性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)が存在するが、このγ−GTP活性を低下させるあるいは欠損させた酵母菌を用いると、酵素法において、グルタチオンを菌体外に高濃度で生産できることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、(1)グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法、(2)γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した株が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子破壊株である(1)に記載のグルタチオンの製造方法、(3)微生物がγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ微生物である、(1)または(2)に記載のグルタチオンの製造方法。(4)グルタチオンの生産能を有する微生物が酵母である(1)〜(3)のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法、(5)酵母がサッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である(4)に記載のグルタチオンの製造方法、(6)膜処理剤と接触させる工程、グルコースと接触させる工程、グルタチオンを構成するアミノ酸またはその誘導体と接触する工程を含む(1)〜(5)のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法、(7)膜処理剤が界面活性剤または有機溶剤である(6)記載のグルタチオンの製造方法、(8)界面活性剤が非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤である(7)記載のグルタチオンの製造方法、(9)γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込み、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を破壊した酵母に関する。本発明の方法によれば、高価なATPや細胞壁分解酵素を使用することなく、比較的安価な界面活性剤および/または有機溶剤などの膜処理剤で処理した酵母培養菌体を用いると、酵素法においてグルタチオンを菌体外に効率よく生産することが可能となる。実施例1及び比較例1〜2における、菌体外でのグルタチオン生産性を比較した図である。実施例2及び比較例3における、菌体外でのグルタチオン生産性を比較した図である。比較例4〜6における、菌体内でのグルタチオン生産性を比較した図である。以下、本発明の方法を詳細に説明する。本発明のグルタチオンの製造方法は、グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いて酵素法によりグルタチオンを微生物菌体外に生産する方法において、該微生物としてγ−グルタミルトランスペプチダーゼ(以降γ−GTPと記す)活性の低下した株を使用する。グルタチオンの生産能を有する微生物とは、グルタチオンの生産能を有する微生物であれば、特に制限はなく、例えば、酵母、細菌が挙げられる。細菌としては大腸菌(Escherichia coli)が挙げられる。酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlesbergensis)、サッカロマイセス・フラギリス(Saccharomyces fragilis)、サッカロマイセス・ルーキシー(Saccharomyces rouxii)などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)、キャンディダ・トロピカリス(Candida toropicalis)などのキャンディダ属、シゾサッカロマオセス・ポンべ(Schizosaccaromyces pombe)などのシゾサッカロミセス属、トルロプシス・バーサティリス(Toluropsis versatilis)、トルロプシス・ペトロフィラム(Toluropsis petrophophilum)などのトルロプシス属、その他ピキア(Pichia)属、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属、マイコトルラ(Mycotorula)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、ハンゼニュラ(Hansenula)属、エンドマイセス(Endomyces)属などの酵母が挙げられる。これら微生物の野生株、突然変異処理や遺伝子操作によりグルタチオンの合成に関与する酵素活性が高められた改良株を使用することができる。中でも、グルタチオンの生産性が高い、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母が好ましい。中でも本発明者らの検討結果によれば、サッカロマイセス属のサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリスが好ましい。遺伝子操作によりグルタチオン合成酵素であるγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を導入し、高発現するようにし、後述のようにγ―GPT遺伝子を破壊した酵母がさらに好ましい。遺伝子の導入方法は特に限定されず、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法が可能であり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などが挙げられる。本発明でγ−GTP活性の低下した株としては、野生株と比較してγ−GTP活性が低下していればよく、特に限定されないが、例えば、γ−GTP活性が低下または消失されるように改変された株が挙げられる。γ−GTP活性が低下または消失するように改変された株は、遺伝子操作的手法で得ることが可能である。例えば、γ−GTP遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素を産生しないように改変した遺伝子、または酵素活性が低下するような変異を有する遺伝子を含むDNAを用いた遺伝子置換により取得することが出来る。具体的には、宿主微生物のゲノム配列のうち、γ−GTP遺伝子をコードしている遺伝子配列の上流領域と相同な配列および選択マーカー遺伝子の5´領域と相同な配列を結合させたDNA−Fを合成する。一方で、γ−GTP遺伝子をコードしている遺伝子配列の下流領域と相同な配列および選択マーカー遺伝子の3´領域と相同な配列を結合させたDNA−Rを合成する。次に、選択マーカー遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、DNA−FおよびDNA−Rをプライマーとして、PCR増幅を行い、増幅されたDNAを宿主微生物に導入する。DNAの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などがある。γ−GTP遺伝子と選択マーカー遺伝子が組換わった目的の遺伝子組換え株は、当該マーカー化合物を含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。また、γ−GTP活性が低下または欠失されるように改変された株は、N−メチル−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホネート(EMS)、UV照射などの通常の変異処理によって取得することもできる。これら微生物の培養は通常の微生物の培養と同様に行えばよい。すなわち炭素源、窒素源、無機物その他の栄養等をほどよく含有しておれば、合成培地、半合成培地、天然(複合)培地のいずれも使用可能である。炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、マニトール、キシロース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物液、糖蜜などの種々の炭水化物原料が使用できる。またピルビン酸、酢酸、乳酸などの各種有機酸、アスパラギン酸、アラニンなどの各種アミノ酸類も使用可能である。窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、あるいは尿素その他の窒素含有化合物ならびにペプトン、NZアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物や加水分解物などの窒素性有機物質あるいはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニンなどの各種アミノ酸が使用可能である。更に無機物としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用できる。培養は振とう培養、通気攪拌深部培養などの好気的培養条件下で実施する。培養時pHは、好ましくは3.0〜8.0、より好ましくは4.0〜6.0、さらに好ましくは4.5〜5.5に制御される。pH制御の中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが使用可能である。好気的培養時の培地への空気供給量(通気量)は、培地1Lに対し、好ましくは0.2L/分以上、より好ましくは0.5L/分以上、さらに好ましくは1L/分以上である。また、総容量2Lのジャーファーメンターを使用して培養する場合、好気的培養条件としては上記通気量に加え、攪拌数は好ましくは200rpm以上、より好ましくは300rpm以上、さらに好ましくは400rpm以上である。また、培養時の温度は、好ましくは20〜45℃、より好ましくは25〜35℃、さらに好ましくは28〜32℃である。培地中への初期細胞濃度(植菌濃度)は酵母の種類、培地組成などにより異なるが、初発濁度(OD600)で好ましくは0.01〜2.0、より好ましくは0.02〜1.0、さらに好ましくは0.1〜0.4である。グルコースなどの上記炭素源に関しては培養初期に一括に仕込んで培養する回分方式、培養期間を通じて少しずつ添加する半回分方式のいずれの方式も適用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、使用する酵母にもよるが、半回分方式の方が増殖速度が向上し、最終菌濃度もより高位となり、菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性も高まるのでより好ましい。半回分方式でグルコースなどの炭素源の流加速度を決定する指標としては培養液の濁度、酸素消費速度、二酸化炭素発生速度、pH調整用中和剤の消費量などが有効利用でき、使用する酵母に合わせて適切な指標を選び、その変化に対応させて炭素源の流加速度を変化させることにより、酵母培養の最適化が図れ、最終菌濃度および菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性向上、その結果グルタチオンの生産性向上が実現できる。培養された菌体を適当な膜処理剤で前処理した後、例えばリン酸バッファー等の反応液中で、グルコース、およびグルタチオンを構成する3つのアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび/またはシスチン、グリシンと接触させることによりグルタチオンを微生物菌体外に生産する事ができる。また、培養された菌体を含む培養液に、直接、適当な膜処理剤を添加し、さらにグルコース、およびグルタチオンを構成する3つの前記アミノ酸と接触させることでも、グルタチオンを微生物菌体外に生産する事ができる。膜処理剤、グルコース、およびグルタチオンを構成する3つのアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび/またはシスチン、グリシンの添加のタイミングとしてはグルタチオンの生成能を有する微生物の培養の途中あるいは培養終了時、あるいはその直前のいずれも適用できるが、工業的には生産速度を高める上で、菌体濃度が高く、さらにはグルタチオン合成酵素活性も高められている培養終了時あるいはその直前が好ましい。膜処理剤としては、界面活性剤および/または有機溶剤が用いられる。界面活性剤としてはセチルトリメチルアンモニウムブロマイド、セチルピリジニウムクロライド、ポリオキシエチレンステアリルアミン、テトラデシルアミン酢酸塩、アルキルイニダゾリン4級塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム・クロライドなどのカチオン系界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムなどのアニオン系界面活性剤、イソオクチルフェニルポリエトキシアルコール(商品名TritonX−100)、ポリエキシエチレンソルビタンモノラウレート(商品名Tween 20)などの非イオン系界面活性剤、ジメチルアルキルベタインなどの両性界面活性剤、ヘキサデシルジメチルアミンなどのアミン系の界面活性剤などいずれも使用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤が合成反応速度の向上、グルタチオンの菌体外への漏出促進の面でより効果的で好ましい。有機溶剤としてはトルエン、キシレン、脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが使用できる。本発明で使用する膜処理剤の濃度としては0.01〜2.0%(w/v)、より好ましくは0.02〜1.0%(w/v)、さらに好ましくは0.1〜0.6%(w/v)である。膜処理された菌体と接触せしめてグルタチオンを得るための反応溶液は、グルタチオンを構成するアミノ酸であるグルタミン酸、システインおよび/またはシスチン、グリシンを含む。ここで用いるグルタミン酸は、ナトリウム塩、カリウム塩などの誘導体であってもよく、またシステイン、グリシンはその塩酸塩などの誘導体であっても良い。基質溶液中の各アミノ酸濃度は反応液中の菌濃度にもよるが、好ましくは1〜800mM、より好ましくは5〜600mM、さらに好ましくは10〜500mMである。生産反応中のpHは使用する酵母にもよるが、好ましくは4〜10、より好ましくは5〜9、さらに好ましくは6〜8、同様に温度は好ましくは10〜50℃、より好ましくは20〜45℃、さらに好ましくは25〜40℃に維持される。反応溶液としては、例えば、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸−リン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーが挙げられる。また、上述のように、培養終了後の菌体を含む培養液中で反応を行うことも可能である。反応液中の菌体量は、好ましくは50〜250(g−湿菌体/L)、より好ましくは100〜200(g−湿菌体/L)である。50(g−湿菌体/L)未満では菌体量が少なく反応速度が遅くなる傾向があり、250(g−湿菌体/L)より多いと反応液の混合状態が悪くなり、やはり反応速度が低下する傾向があるので好ましくない。反応溶液には、必要に応じて反応を促進する成分を添加することもできる。反応を促進する成分としては硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム化合物および酵素反応のエネルギー源としてのグルコース、廃糖蜜、ハイテストモラセス、コーンスティープリカーなど、さらには補酵素であるニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)、フラビン−アデニンジヌクレオチド(FAD)、フラビンモノヌクレオチド(FMN)などが挙げられる。必要に応じてこれらを添加すれば反応効率を一層高めることが出来る。菌体外に生産されたグルタチオンの精製方法としては通常の方法が適用できる。すなわち菌体をろ別(遠心分離)後、例えば銅塩沈殿、またはイオン交換樹脂等を用いて精製し、真空凍結乾燥により粗グルタチオン粉末を得、アルコール沈殿操作を数回繰り返すことにより、精製グルタチオンを得ることが出来る。本発明者らの検討結果によれば、興味深いことに、通常の発酵法により菌体内にグルタチオンを蓄積させる方法でγ−GTP活性が低下あるいは欠失した株を用いた場合には、γ−GTP活性を低下あるいは欠失させる前の親株との比較においてグルタチオン生産量の向上効果は認められず、本発明の方法で開示されたような膜処理剤と接触させることにより細胞膜の透過性を促進し、グルタチオンを酵素法により菌体外に生産するようにした場合にのみ顕著なグルタチオンの生産性向上効果が認められた。この理由については現時点では明らかではないが、熊谷の報告(非特許文献:化学と生物,24,135,(1986))によればγ−GTPは細胞内で細胞膜上あるいはペリプラズム空間に局在していることが示唆されている。このようなγ−GTPの細胞内局在を考えると、通常の培養で、発酵法によりグルタチオンを菌体内に蓄積させた場合は菌体外に漏出するグルタチオンは極僅かであり、これらが細胞膜を通過する際にγ−GTPと接触、分解されてもその量が僅かであると考えられる。したがってγ−GTP活性が低下あるいは欠失していない親株との比較において蓄積量には向上効果が認められなかったのではないかと推察される。一方、膜処理剤を用い、酵素法により菌体外にグルタチオンを生産する方法ではグルタチオンの膜透過性が増し、グルタチオンが漏出する際、容易にγ−GTPと接触しやすくなる、またγ−GTPも菌体外に漏洩し、菌体外でのグルタチオンの分解も一層促進されるのではないかと考えられる。したがって本発明の方法で開示された菌体外にグルタチオンを生産する方法ではγ−GTP活性を低下あるいは欠失させた株を用いることにより、顕著な生産性向上効果が認められたのではないかと推察している。次に本発明の方法を、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。(製造例1)GSH1、2増強株の作成方法γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(gsh1)をSaccharomyces cerevisiae YPH499のゲノムDNAをテンプレートとし、プライマーとして、5’−GACTAGTATGGGACTCTTAGCTTTGGGC−3’(配列番号1)および5’−TCAGATCTTTAACATTTGCTTTCTATTGAAGGCTTATTT−3’(配列番号2)を用いてPCR増幅を行い、増幅物をSpeIおよびBglIIで消化して、2039bpのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子SpeI−BglII断片を得た。この断片を非特許文献(J.Biochem:145:701−708(2009))に記載のpGK402のSpeI−BamHI消化部位に連結し、γ−グルタミルシステイン合成酵素発現プラスミドpGK402−γ−GCSを得た。また、グルタチオン合成酵素遺伝子(gsh2)をSaccharomyces cerevisiae YPH499のゲノムDNAをテンプレートとし、プライマーとして、5’−ACGCGTCGACATGGCACACTATCCTTCC−3’(配列番号3)および5’−GGCAGATCTCTAGTAAAGAATAATACTGTCCAAACATCCG−3’(配列番号4)を用いてPCR増幅を行い、増幅物をSalIおよびBglIIで消化して、1478bpのグルタチオン合成酵素遺伝子SalI−BglII断片を得た。この断片を非特許文献(J.Biochem.(2009)145:701−708)に記載のpGK405のSalI−BglI消化部位に連結し、グルタチオン合成酵素発現プラスミドpGK405−GSを得た。得られたプラスミドpGK402−γ−GCSおよびpGK405−GSを制限酵素StuIおよびEcoRIで消化した。Saccharomyces cerevisiae YPH499を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCSを得た。(製造例2)GSH1、2増強+γ−GTP欠損株の作成方法製造例1で取得した組換え酵母YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株のゲノム配列のうち、γ−GTP遺伝子をコードしている遺伝子配列cis2の上流領域50塩基と相同な配列およびhis3遺伝子の開始コドンから25塩基と相同な配列を結合させたDNA−Fを合成する。一方で、cis2遺伝子配列の下流領域50塩基と相同な配列およびhis3遺伝子の終止コドンから25塩基と相同な配列を結合させたDNA−Rを合成する。次に、his3遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、DNA−FおよびDNA−Rをプライマーとして、PCR増幅を行い、増幅されたDNAをYPH499株に導入した。DNAは、酢酸リチウムを用いた形質転換法により宿主に導入した。γ−GTP遺伝子とhis3遺伝子が組換わった目的の遺伝子組換え株は、ヒスチジンを含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。この結果、組換え酵母YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS、Δγ−GTP株を得た。(実施例1)遺伝子組換えγ−GTP欠損株の菌体外でのグルタチオン生産製造例2で取得した組換え酵母YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS、Δγ−GTP株を、YPD培地(10g/L酵母エキストラクト(Difco laboratories製)、20g/Lポリペプトン(和光純薬(株)製)、20g/Lグルコース(ナカライテスク(株)製))5mlで30℃、16時間振盪することにより種母培養を行った。次にYPD培地20mlを含むバッフル付き三角フラスコにOD600=0.03となるよう植菌し、30℃、150rpmの条件で24時間培養を行った。培養後の酵母菌体を回収し、湿重量2gの酵母菌体に、反応液(0.2M phosphate buffer(pH 7.0),0.4% Triton X−100,20 mM MgCl2,10 mM CaCl2,0.4 M Glucose,10 mM L−glutamic acid,10 mM L−cysteine,10 mM Glycine)20mlを添加し、バッフル付き三角フラスコにて37℃、200rpmで24時間反応させた。反応終了後の反応液のグルタチオン(GSH)濃度(mg/l)を測定した。グルタチオンは次のようにして分析した。サンプリングした培養液10mlを遠心分離により上清を除去した後、蒸留水で沈殿した菌体を懸濁、再遠心することにより洗浄した。本洗浄操作を2回繰り返した後、遠心分離後に沈殿する菌体を−80℃で冷凍保管し、凍結乾燥後、得られる凍結乾燥物に5mlのHPLC移動相(3%(v/v)アセトニトリル、0.20%(w/v)1−ヘプタンスルホン酸Na,96.8%リン酸二水素カリウム緩衝液(pH2.8))を添加、懸濁し、その1mlを85℃で5分間熱処理後に遠心分離し、その上清中のグルタチオンを高速液体クロマトグラフィーにて分析した。(比較例1)親株の菌体外でのグルタチオン生産γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子及びグルタチオン合成酵素遺伝子を導入せず、野生型γ−GTP遺伝子を有しているSaccharomyces cerevisiaeYPH499株を使用した以外は実施例1と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン(GSH)濃度(mg/l)を測定した。(比較例2)遺伝子組換え株の菌体外でのグルタチオン生産製造例1で取得した組換え酵母YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株を使用した以外は実施例1と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン(GSH)濃度(mg/l)を測定した。実施例1、比較例1及び2の結果を図1に示す。図1からわかるように、親株であるYPH499株のグルタチオン(GSH)濃度が305mg/lであったのに対し、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株では、グルタチオン(GSH)濃度が430mg/lと高まった。この結果より、γ−グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の発現によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。また、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入し、さらにγ−GTP遺伝子を破壊したYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS、Δγ−GTP株では、グルタチオン(GSH)濃度が510mg/lとYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株を上回り、γ−GTP破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。(実施例2)遺伝子組換えγ−GTP欠損株の菌体外でのグルタチオン生産製造例2で取得した組換え酵母YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS、Δγ−GTP株をYPD培地(10g/L酵母エキストラクト(Difco laboratories製)、20g/Lポリペプトン(和光純薬(株)製)、20g/Lグルコース(ナカライテスク(株)製))5mlで30℃、16時間振盪することにより種母培養を行った。次にYPD培地20mlを含むバッフル付き三角フラスコにOD600=0.03となるよう植菌し、30℃、150rpmの条件で24時間培養を行った。培養終了後の培養液にTriton X−100(0.4%),MgCl2(20mM),CaCl2(10mM),Glucose(0.4M),L−glutamic acid(500mM),L−cysteine(120mM),Glycine(60mM)(括弧内の記載は、培養終了後の培養液量を基準に計算した)を直接添加し、バッフル付き三角フラスコにて37℃、200rpmで24時間反応させた。反応終了後の反応液のグルタチオン(GSH)濃度(mg/l)を測定した。(比較例3)遺伝子組換え株の菌体外でのグルタチオン生産製造例1で取得した組換え酵母YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株を使用した以外は実施例2と同様にして、反応終了後の反応液のグルタチオン(GSH)濃度(mg/l)を測定した。実施例2及び比較例3の結果を図2に示す。図2からわかるように、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株では、グルタチオン(GSH)濃度が1450mg/lであったのに対し、さらにγ−GTP遺伝子を破壊したYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS、Δγ−GTP株では、グルタチオン(GSH)濃度が3300mg/lとYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株を上回り、γ−GTP破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。(比較例4)親株の菌体内でのグルタチオン生産γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(gsh1)及びグルタチオン合成酵素遺伝子(gsh2)を導入せず、野生型γ−GTP遺伝子を有しているSaccharomyces cerevisiaeYPH499株を、YPD培地(10g/L酵母エキストラクト(Difco laboratories製)、20g/Lポリペプトン(和光純薬(株)製)、20g/Lグルコース(ナカライテスク(株)製))5mlで30℃、16時間振盪することにより種母培養を行った。次にYPD培地20mlを含むバッフル付き三角フラスコにOD600=0.03となるよう植菌し、30℃、150rpmの条件で24時間培養を行った。培養終了後の培養液から菌体を回収し、菌体中のグルタチオン含量、菌濃度(OD600)を測定した。得られた菌体中のグルタチオン含量および菌濃度を掛け合わせることで、培養液あたりのグルタチオン(GSH)濃度(mg/l)を算出した。(比較例5)遺伝子組換え株の菌体内でのグルタチオン生産製造例1で取得した組換え酵母YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株を使用した以外は比較例4と同様にして、培養液あたりのグルタチオン(GSH)濃度(mg/l)を算出した。(比較例6)遺伝子組換えγ−GTP欠損株の菌体内でのグルタチオン生産製造例2で取得した組換え酵母YPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS、Δγ−GTP株を使用した以外は比較例4と同様にして、培養液あたりのグルタチオン(GSH)濃度(mg/l)を算出した。比較例4〜6の結果を図3に示す。図3からわかるように、親株であるYPH499株のグルタチオン(GSH)濃度が26mg/lであったのに対し、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入したYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株では、グルタチオン(GSH)濃度が53mg/lと高まった。本結果より、γ−グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の発現によるグルタチオンの生産性の向上効果が見られた。また、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子を導入し、さらにγ−GTP遺伝子を破壊したYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS、Δγ−GTP株では、グルタチオン(GSH)濃度が46mg/lとYPH499/pGK405−GS、pGK402−γ−GCS株よりも低く、γ−GTP破壊によるグルタチオンの生産性の向上効果は菌体内にグルタチオンを蓄積させる従来の方法では認められなかった。グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法。γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した株が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子破壊株である請求項1記載のグルタチオンの製造方法。微生物がγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ微生物である、請求項1または2記載のグルタチオンの製造方法。グルタチオンの生産能を有する微生物が酵母である請求項1〜3のいずれか1項記載のグルタチオンの製造方法。酵母がサッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である請求項4記載のグルタチオンの製造方法。膜処理剤と接触させる工程、グルコースと接触させる工程、および、グルタチオンを構成するアミノ酸またはその誘導体と接触する工程を含む請求項1〜5のいずれか1項記載のグルタチオンの製造方法。膜処理剤が界面活性剤または有機溶剤である請求項6記載のグルタチオンの製造方法。界面活性剤が非イオン性界面活性剤あるいはアニオン性界面活性剤である請求項7記載のグルタチオンの製造方法。γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子及びグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を組み込み、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を破壊した酵母。 【課題】グルタチオンの経済的な工業生産方法を提供する。【解決手段】グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いた酵素法によるグルタチオンの製造方法において、該微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が低下した微生物であることを特徴とする、グルタチオンの製造方法。【選択図】なし配列表


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